저분자 SPR 분석에서 DMSO Correction 원리와 계산 방법
DMSO Correction은 저분자 SPR(Surface Plasmon Resonance) 분석에서 정확한 결합 신호를 얻기 위해 수행하는 필수 과정이다. 저분자의 결합 신호는 일반적으로 5~10 RU 수준으로 매우 작다. 반면 DMSO 농도의 미세한 변화는 수백에서 수천 RU의 bulk signal을 유발한다. 따라서 solvent effect를 보정하지 않으면 affinity 결과를 정확하게 해석하기 어렵다.
저분자 SPR 분석에서는 DMSO 농도 변화에 따른 굴절률 변화가 큰 오차를 만든다. Solvent correction은 calibration curve를 이용하여 reference subtraction 후 남아 있는 residual error를 제거하는 과정이다.
[그림 1] 저분자 SPR 분석에서 DMSO Correction 개념
목차
DMSO Correction의 기본 개념
Bulk Refractive Index란 무엇인가?
SPR 센서는 표면 부근의 굴절률 변화를 측정한다. 이를 Bulk Refractive Index(Bulk RI)라고 한다.
DMSO 농도가 변하면 용액의 굴절률도 변한다. 이 변화는 실제 결합과 무관하게 RU(Response Unit) 변화를 유발한다.
Reference subtraction만으로 충분하지 않은 이유
Active flow cell에는 ligand가 존재하지만 reference flow cell에는 존재하지 않는다. 따라서 두 표면은 동일하지 않다.
Ligand가 차지하는 부피 때문에 active surface에서는 bulk solution이 일부 배제된다. 이를 Excluded Volume Effect라고 한다.
이 때문에 reference subtraction 이후에도 작은 residual error가 남게 된다.
고정화량이 많을수록 오차가 증가하는 이유
Ligand immobilization density가 높을수록 active surface와 reference surface의 bulk contribution 차이가 커진다.
따라서 residual error 역시 증가한다.
왜 단백질 분석에서는 영향이 작을까?
Macromolecule 분석에서는 결합 신호가 수백 RU 수준이다. 일반적인 aqueous buffer 조건에서는 solvent effect의 영향이 상대적으로 작다.
반면 저분자 분석에서는 결합 신호가 5~10 RU 수준에 불과하기 때문에 solvent correction이 매우 중요하다.
DMSO 농도 변화가 Response에 미치는 영향
1% DMSO가 만드는 Bulk Response
1% DMSO 농도 변화는 약 1200 RU의 bulk response를 발생시킨다.
저분자 분석에서 Signal이 작은 이유
Fragment나 drug candidate의 결합 신호는 5~10 RU 수준인 경우가 많다.
작은 DMSO 변화가 큰 오류를 만드는 이유
0.01~0.05% 수준의 DMSO 농도 차이만으로도 실제 binding signal보다 큰 solvent artifact가 발생할 수 있다.
따라서 fragment screening에서는 false positive와 false negative를 줄이기 위해 solvent correction이 필수적이다.
[그림 2] 저분자 분석에서 solvent artifact의 영향
DMSO Correction의 원리
Solvent Correction Cycle이란?
기준 DMSO 농도보다 높은 농도와 낮은 농도의 solvent solution을 순차적으로 주입한다.
이 과정을 통해 calibration 데이터를 생성한다.
Correction Curve 생성 과정
Reference flow cell의 response를 X축으로 사용한다.
Reference subtraction 후 남아 있는 residual response를 Y축으로 사용한다.
이 두 값의 관계로 solvent correction curve를 생성한다.
| Reference response (RU) | Active-Reference residual response (RU) |
|---|---|
| -500 | +8 |
| 0 | 0 |
| 500 | -9 |
| 1000 | -18 |
Correction 값 계산 예시
Solvent correction은 500 RU의 bulk signal 자체를 제거하는 과정이 아니다.
Reference subtraction 이후에도 남아 있는 residual error를 제거하는 과정이다.
실제 Sample의 Correction 계산
어떤 sample의 측정 결과가 다음과 같다고 가정하자.
Reference flow cell response = +500 RU
Measured Active-Reference response = 16 RU
Calibration curve에서 Reference response가 +500 RU일 때 correction 값은 약 -9 RU가 된다.
Measured response = 16 RU
Correction value = -9 RU
Corrected response = 16 RU - 9 RU = 7 RU
즉, 측정된 16 RU 중 약 9 RU는 solvent artifact이며 실제 binding response는 7 RU이다.
Biacore 8K의 Interpolation 기능
최신 Biacore 시스템은 실험 시작과 종료 시점뿐 아니라 일정 간격마다 solvent correction cycle을 수행한다.
각 sample cycle은 앞뒤 두 개의 correction curve 사이에 위치한다.
Biacore 8K 이후 시스템은 interpolation을 이용하여 해당 시점의 correction factor를 계산한다.
이 기능은 장시간 실험에서 발생하는 drift를 보상할 수 있으며 구형 장비보다 더 안정적인 결과를 제공한다.
Solvent correction solution과 sample은 동일한 희석 방법으로 제조하는 것이 중요하다. 단순히 동일한 DMSO 농도로 맞추는 것만으로는 충분하지 않다. DMSO는 흡습성이 있으므로 stock solution은 가능한 한 외부 공기와의 접촉을 최소화해야 한다.
인사이트 키워드: DMSO Correction, Bulk Refractive Index, Calibration Curve, Fragment Screening